背景介绍

裸露的RNA作为一种带负电荷的亲水性大分子，由于细胞膜的静电排斥很难进入细胞，同时也容易被广泛存在的RNA酶迅速降解，因此需要一种保护性外壳来帮助RNA进入细胞。细胞膜主要由脂质组成，利用脂质囊泡包裹RNA可以有效穿越细胞膜并将RNA释放到细胞质中。为了与带负电荷的RNA结合，囊泡本身应带有正电荷。然而，持续性阳离子脂质组成的囊泡可能引发细胞毒性，因为它们与带负电荷的细胞膜产生静电作用。因此，脂质结构也必须在内体的酸性环境中对带正电荷的分子做出反应。

脂质纳米粒结构

脂质纳米粒(LNP)通常由四种关键成分组成：可离子化的阳离子脂质、磷脂（两性离子脂质）、胆固醇和PEG化脂质。LNP作为mRNA传递系统，其作用机制涉及多个步骤，确保mRNA能够安全有效地递送到目标细胞并表达出相应蛋白质。其中，可离子化阳离子脂质是关键成分，它能在自组装期间以其低于Ka的情况带正电荷，从而负载带负电荷的RNA。此时在中性pH下不带电，最大限度地减少毒性，待细胞吸收后再在内体pH降低的环境中重新带上正电荷以促进内体逃逸。同时，胆固醇和PEG化的脂质变体能够调节LNP的物理性质和纳米结构，进而增强其最终效果。两性离子磷脂通常被称为“辅助脂质”。LNP在保护mRNA、促进细胞内传递及激活免疫反应中发挥了至关重要的作用。

LNP转染实验步骤

以下转染步骤以6孔板单孔参考条件为例，其他培养形式请参考表1。

1. mRNA预混液制备

将25μg mRNA（浓度为1μg/μL）与60μL缓冲液混合。

2. mRNA-easyLNP复合物制备

将625μL mRNA预混液与625μL easyLNP纳米悬液混合，涡旋2-3秒，确保均匀。

3. 添加细胞

将125μL mRNA-easyLNP复合物加入细胞中，轻轻晃动以确保均匀分散。

4. 分析时间

在培养24-48小时后进行分析。

表1: 基于细胞培养容器的mRNA转染指南

培养形式	mRNA预混液制备	mRNA-easyLNP复合物制备	添加细胞
96孔板	40ng/μL	25μL	5μL
24孔板	12μL	125μL	25μL
6孔板	60μL	625μL	125μL

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